-Protocol-

ProbeラベルのためのNick Translationプロトコール

Ａ．プローブのラベル：
Ａ−１） Vysis Nick Translation Kitプロトコール
　　準備：　
　　１）  0.2 mM SpectrumGreen dUTP（別売）　（あるいはSpectrumRed, SpectrumOrange）
　　　　(溶解前の50 nmol dUTPは、50 mLのTE or H20に溶かすと1mM dUTPになる。)
　　　　0.5 mLの1 mM dUTPを2 mLの nuclear-free water（添付のもの）に加える。
　　２） 0.1 mM dTTP
　　　　2 mLの0.3 mM dTTPを4 mLの nuclear-free water（添付のもの）に加える。
　　３） 0.1 mM dNTP mix
　　　　それぞれ、3.5 mLの0.3 mM dATP, 0.3 mM dCTP, 0.3 mM dGTPを混ぜる。
　　４） BAC
　　　　DNAを0.2 から1 mg/mLの濃度にTris-EDTA (10mM Tris, 1 mMEDTA, pH8.5)で調
　　　　 整する。
　　　　（ジェノテックスからの精製DNAは25mgを90 mLに溶かしてある。= 0.28 mg/mL）

ラベル（１０回分）：
　　１）microcentrifuge tubeを氷の上で冷やす。
　　２）以下の試薬を以下の順にtubeに入れ、遠沈し、Vortex・遠沈する。
　　　　　　17.5　x　      mL             nuclease-free water（添付のもの）
　　　　　　　　　x          mL               1 mg BAC DNA
　　　　　　　　2.5          mL          0.2 mM SpectrumGreen dUTP
　　　　　　　　5.0          mL               0.1 mM dTTP mix
　　　　　　　　10.0         mL          0.1 mM dNTP mix
　　　　　　　　5.0          mL          10X nick translation buffer
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　　　　　 total      40.0        mL

＊ジエノテックスの場合
　　　　　13.9 mL nuclease-free water（添付のもの）
　　　　　 3.6         mL               1 mg BAC DNA
　　　　　 2.5         mL               0.2 mM SpectrumGreen dUTP
　　　　　　5          mL               0.1 mM dTTP mix
　　　　　10           mL               0.1 mM dNTP mix
　　　　　 5            mL               10X nick translation buffer
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　　　　　　　total 40 mL

　　３） 10 mL nick translation enzymeを加え、計50        mLとする。
　　４） 短くVortexし、遠沈する。
　　５） 8-16時間15度でインキュベートする。
　　６） 70℃のwater bathに10分入れ、反応を止める。
　　７）　氷で冷やす。
　　８）　エタノール沈殿（後述）を行い、FISH時のprobeの濃度が適当
　　　　(通常は1-2 mg/mL)になるようにhybridization溶液を加える。

Ａ−２） Roche Nick Translation Dig ／Biotin　Kitプロトコール Dig ／Biotinラベルキット
　　１） 1 mgのラベルしたいDNAをtubeに入れ、DDWを加えて、16 mLにする。
　　　　（ジェノテックスからの精製DNAは25mgを90 mLに溶かしてある。= 0.28 mg/mL）
　　　　よって、3.5 mLをtubeに入れ、12.5 mLのDDWを加える。
　　２） 4 mLのDIG-(or Biotin-)Nick translation mixを加え、Vortexし、短時間遠沈する。
　　３） 15℃で90分間、インキュベートする。
　　　　　　非特異蛍光が多い時は、６時間、１２時間ぐらいも試してみる。
　　４） 1 mLの0.5 M EDTA (pH 8.0)を加えて、65℃で10分間、インキュベートし、反応を止
　　　　める。
　　５） エタノール沈殿（後述）を行い、FISH時のprobeの濃度
　　　　(通常は1-2 mg/mL)になるようにhybridization溶液を加える。

Ａ−３）Roche Nick Translation 蛍光ラベル　Kitプロトコールラベルキット
Ａ．ラベル
　１）蛍光ラベルミックスを別のmicro tubeに作成する。
　　　　1-1) dATP, dCTP, dGTP, dTTPを0.5mLとり、４０倍希釈する。
　　　　1-2) 希釈したdATP, dCTP, dGTPを各5mL 入れる。
　　　　1-3) 希釈したdTTPを各3.4mL 入れる。
　　　　1-4) FITC-12-dUTP (あるいは tetramethyl-rhodamine-6-dUTP)を4mL加える
　　　　1-5) DDWを加えて、最終50 mLにする。
　２）１mgのラベルしたいDNAをtubeに入れ、DDWを加えて、12 mLにする。
　　　（ジェノテックスからの精製DNAは25mgを90 mLに溶かしてある。= 0.28 mg/mL）
　　　よって、3.6 mLをtubeに入れ、8.4 mLのDDWを加える。
　３）１）で作成したの蛍光ラベルミックスを４ mL加える。
　４）4 mLのNick translation mixを加え、Vortexし、短時間遠沈する。
　５）15℃で90分間、インキュベートする。
　　　　　非特異蛍光が多い時は、６時間、１２時間ぐらいも試してみること。
　６) 1 mLの0.5 M EDTA (pH 8.0)を加えて、65℃で10分間、インキュベートし、反応を止め
　　　る。
　７）エタノール沈殿（後述）を行い、FISH時のprobeの濃度
　　　(通常は1-2 mg/mL)になるようにhybridization溶液を加える。

Ｂ．プローブの沈降：
　１）5mL(<100 ng probe)のnick translation反応液をtubeに入れる。
　２）1 mL (1 mg)のCOT-1 DNA (1 mg/mL, Vysis), 0.2 mL (2 mg)の
　　 human placental DNA (10 mg/mL, Sigma D-3287), 5.8 mLのDDWをtubeに入れる。
　３）1.2 mL(0.1 volume)の3M sodium acetate (NaOAc, pH 5.5)を加える。
　　＊3M sodium acetate (NaOAc, pH 5.5)の作成方法
　　　　　　　40.83 gmのsodium acetateを80 mlのH2Oに溶かす。
　　　　　　　酢酸でpHを5.2に合わせた後、H2Oを加えて、100 mlにする。
　　　　　　　Autoclaveをかける。
　４）30 mL(2.5 volume)の100%EtOHを加え、短くVortexし、氷上に15分間置く。
　５）12000 rpm, 30分, 4℃で遠沈する。
　６）上澄みを除去し、10-15分間、RTで真空吸引する。
　７）3 mLのDDWと7 mLのhybridization buffer (Vysis)を加えて、再溶解する。
　８）73℃のwater bathに5分間つけて、denatureする。